🔬 Laboratorio Virtual · Bases Funcionales de la Medicina III

Técnicas Bioquímicas

Simula, aprende y domina las 4 técnicas para tu certamen

💡

Espectrofotometría

Cuantifica biomoléculas midiendo la absorción de luz. Ley de Lambert-Beer.

Cuantitativa

⚡

Electroforesis & Western Blot

Separa moléculas por tamaño en campo eléctrico. Detecta proteínas específicas.

Separativa

🧬

PCR

Amplifica exponencialmente ADN/ARN. 3 etapas por ciclo: 2ⁿ copias.

Molecular

🧪

ELISA

Detecta antígenos o anticuerpos con alta sensibilidad mediante enzimas.

Inmunológica

Técnica 01 · Espectrofotometría

💡 Espectrofotometría

Concentración 5.0 mM

Longitud de onda 540 nm

A = 0.50

%T = 32%

C = 5.0 mM

λ = 540 nm

A = ε · b · C | A = −log(T) | T = P/P₀

⚙️ Fundamento Molecular

La luz monocromática atraviesa la muestra. Los cromóforos (grupos insaturados: C=C, C=O, anillos aromáticos) absorben fotones cuando su energía coincide con ΔE del enlace. La Ley de Lambert-Beer establece proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración.

A = ε(λ) · b · C

📋 Métodos Cuantitativos

Absoluto: C = A / (ε·b) — requiere conocer ε
Factor: C_MP = A_MP × (C_ST/A_ST)
Curva calibrado: interpolación en y=mx+n — más preciso

🏥 Aplicaciones Clínicas

Glucosa → λ 340 nm

Enzimático: HK + G6PDH → NADH absorbe a 340nm

Proteínas totales → λ 540 nm

Reactivo Biuret: complejo Cu²⁺-péptido violeta

Hemoglobina → λ 540 nm

Reactivo Drabkin: HbFe(III)CN — cianometahemoglobina

ADN/ARN → λ 260 nm

Bases nitrogenadas absorben en UV. Ratio 260/280 indica pureza.

Técnica 02 · Electroforesis & Western Blot

⚡ Electroforesis & Western Blot

1.Carga

2.Migración

3.Tinción

4.Western Blot

Estado: Listo para correr

Voltaje: 80V

⚙️ Principio SDS-PAGE

El SDS desnaturaliza proteínas y las recubre de carga negativa uniforme proporcional al tamaño. En el campo eléctrico, migran solo por peso molecular: menores MW → migran más (poros del gel actúan como tamiz).

🔬 Western Blot — 6 Pasos

SDS-PAGE: separar por tamaño molecular
Transferencia a membrana PVDF/nitrocelulosa
Bloqueo con leche/BSA (evita unión inespecífica)
Anticuerpo 1° específico contra proteína target
Anticuerpo 2° + enzima HRP (amplificación)
Sustrato → quimioluminiscencia → banda visible

🏥 Aplicaciones Clínicas

Confirmación VIH

Detecta Ac contra gp160, gp120, gp41 (env), p55, p24 (gag), p66, p31 (pol). ≥2 bandas = positivo.

Electroforesis sérica

Separa: Albúmina, α1, α2, β, γ-globulinas. Detecta mieloma múltiple (banda M monoclonal en γ).

Investigación oncológica

Detecta expresión/sobreexpresión de proteínas en tumores. Evalúa vías de señalización.

Técnica 03 · PCR

🧬 PCR — Reacción en Cadena de la Polimerasa

95°C Desnaturalización

55°C Alineamiento

72°C Extensión

Ciclo: 0/30

Fase: —

Copias: 1

Temp: —

🔥 Los 3 Pasos del Ciclo

95°C — Desnaturalización

El calor rompe puentes de hidrógeno entre bases. La doble hélice se separa en cadenas simples (molde para síntesis).

50-65°C — Alineamiento (Annealing)

Los primers (oligonucleótidos sintéticos cortos) se hibridan con su secuencia complementaria en el molde.

72°C — Extensión

La Taq polimerasa (termoestable de T. aquaticus) sintetiza la nueva cadena 5'→3' incorporando dNTPs.

📈 Amplificación Exponencial

Copias = 2ⁿ (n = número de ciclos)

30 ciclos → 2³⁰ ≈ 1.000 millones de copias a partir de una sola molécula

🏥 Tipos y Usos Clínicos

PCR Convencional

Detecta presencia/ausencia de ADN. Diagnóstico genético, fibrosis quística (ΔF508 CFTR).

RT-PCR (ARN→ADNc→PCR)

Requiere retrotranscriptasa. Diagnóstico SARS-CoV-2, influenza, VIH, VHC.

qPCR (fluorescencia en tiempo real)

Cuantifica carga viral VIH/HBV/HCV. Valor Ct inversamente proporcional a copias iniciales.

Técnica 04 · ELISA

🧪 ELISA — Inmunoensayo Enzimático

Captura

Incubación

Detección

Lectura

Paso: Ac. captura inmovilizados en pocillo

⚙️ Principio ELISA Sándwich

Captura: Ac. específico fijado a la placa de 96 pocillos
Muestra: Antígeno se une al Ac. de captura (lavados)
Bloqueo: BSA o leche descremada impide unión inespecífica
Ac. primario: Reconoce epítopo diferente del antígeno
Ac. 2° + HRP: Amplifica señal enormemente
Sustrato TMB: HRP cataliza cambio de color → absorbancia

⚖️ Tipos de ELISA

Directo

Ac. primario marcado directamente con enzima. Rápido pero menos sensible.

Indirecto

Detecta Ac. del paciente. Se usa para tamizaje serológico (VIH, Hep B/C).

Sándwich ⭐ Más sensible

Dos Ac. flanquean al Ag. Alta especificidad para proteínas grandes.

🏥 Aplicaciones Críticas

🔴 VIH (tamizaje)

🔴 Hepatitis B y C

🔴 COVID-19 Ac.

🔴 Test embarazo (hCG)

🔴 TSH / tiroides

🔴 Insulina

🔴 Citocinas IL-6

🔴 Dengue

📊 Comparación de Técnicas

Técnica	Principio	Detecta	Detección	Aplicación Clave
💡 Espectrofotometría	Absorción de luz (λ específica)	Moléculas en solución	Absorbancia / Lambert-Beer	Glucosa, colesterol, Hb, ADN
⚡ Electroforesis	Migración en campo eléctrico por MW	ADN, ARN, proteínas	Tinción (Coomassie, EtBr)	Electroforesis sérica, mieloma
🔬 Western Blot	SDS-PAGE + reconocimiento Ac-Ag	Proteína específica	Quimioluminiscencia ECL	Confirmación VIH, oncología
🧬 PCR convencional	Amplificación ADN (3 etapas×ciclos)	Fragmento ADN específico	Gel de electroforesis	Diagnóstico genético, fibrosis quística
🔁 RT-PCR	ARN→ADNc→PCR	ARN viral o expresión génica	Gel de electroforesis	SARS-CoV-2, influenza, VIH
📊 qPCR	PCR + fluorescencia en tiempo real	Cantidad de ADN (Ct value)	Fluorescencia (curva)	Carga viral VIH/HBV/HCV
🧪 ELISA	Interacción Ag-Ac + enzima	Antígenos o anticuerpos	Absorbancia colorimétrica	VIH tamizaje, hCG, TSH, COVID-19

💡 SPECTRO = Cuánto hayMide concentración de biomoléculas. Clave: A = εbC

⚡ ELECTRO = Qué tamaño tieneSepara por MW. WB: identifica proteína específica

🧬 PCR = Lo copio millones de vecesAmplifica ADN. 2ⁿ copias. Detecta secuencias mínimas

🧪 ELISA = Lo busco con anticuerposAg-Ac específico + enzima + color = concentración

🎯 Quiz Certamen